近日，浦合醫藥在歐洲藥物化學雜志 (European Journal of Medicinal Chemistry)公開了其臨床3期小分子EGFR抑制劑YK-029A的研發過程。
靶向表皮生長因子受體 (EGFR) 敏感驅動突變del19或L858R (21號外顯子)，在非小細胞肺癌領域獲得了巨大的成功。自第一個EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)吉非替尼于2003年被FDA批準后，多個EGFR抑制劑(1代:吉非替尼和厄洛替尼，2代:阿法替尼和達可替尼，3代:奧希替尼)也相繼被批準，并表現出了良好的臨床療效。不幸的是，對于EGFR 20外顯子插入突變(EGFRex20ins)的非小細胞肺癌患者，其可選擇的治療方式有限，目前主要采用化療或免疫治療。此外，敏感突變的患者在使用第一代抑制劑治療時可能會因獲得性T790M耐藥而出現疾病復發，而在使用第一代抑制劑的患者中，T790M耐藥人群又占據了最高比例。鑒于EGFR突變的非小細胞肺癌患者面臨巨大的臨床未滿足需求，浦合醫藥希望找到一種新的分子來同時解決上述兩個難題。
T790M，也被稱為gatekeeper突變，其導致對吉非替尼(或厄洛替尼)的活性降低的原因有如下兩點: 1)甲硫氨酸殘基側鏈與抑制劑發生空間位阻; 2) T790M共突變體(del19/T790M或L858R/T790M)對ATP的親和力大大增加。T790M共突變也是第二代不可逆TKI (如阿法替尼)的主要耐藥機制。最近，奧希替尼被發現可有效抑制T790M共突變患者的腫瘤生長，無進展生存期(PFS)達12.3個月。此外，阿美替尼和氟美替尼也在中國被批準用于治療T790M共突變的晚期非小細胞肺癌患者。
EGFR20外顯子 (氨基酸插入位置 762-774)位于EGFR的C-螺旋處, 大約4-7%的非小細胞患者含有20外顯子插入突變，且包含數十種插入類型：包括但不限于A763_Y764insFQEA, V769_D770insASV, D770_N771insSVD, D770_N771insNPG 和 H773_V774ins_NPH等。因此，大部分20外顯子插入的結構解析是缺失的。2013年, Yasuda 等人報道了EGFR D770_N771insNPG插入突變的晶體結構，并發現NPG的插入使得EGFR持續激活，但并未降低其與ATP的親和力。與之相對比的是, FQEA 插入到氨基酸A736_Y764之間，形成了一個額外的螺旋結構, 并使得相鄰殘基向N端移動，并穩定了L858周圍的輸水作用，從而使得蛋白處于非活性態。非常不幸的是，由于缺乏足夠的安全治療窗口，基本上所有傳統的EGFR抑制劑對于20外顯子插入突變均無效。最近, EGFR-MET雙抗：amivantamab，被FDA批準用于治療鉑類耐藥后的2線EGFRex20ins插入患者；mobocertinib (TAK-788; Figure 1) 也基于其治療2線EGFRex20ins的出色 ORR (43%) 被FDA批準。盡管如此，目前在EGFRex20ins初治患者(1線)中，尚未有良好的治療手段。浦合醫藥的新一代EGFR抑制劑YK-029A目前正在開展頭對頭含鉑化療在1線EGFR20外顯子插入初治患者中的三期臨床試驗。
Figure 1. 代表性EGFR抑制劑結構
靶向EGFRex20ins設計的最大挑戰就是對于野生型EGFR (wt-EGFR)的選擇性。敏感突變 (del19 或L858R) 相比 wt-EGFR對于ATP的結合力大大降低；而 EGFRex20ins突變則提高了與ATP的親和力。因此，對于20號外顯子插入突變活性的提高通常也使得選擇性降低，而失去治療窗口。脫靶野生型EGFR的抑制在臨床上會帶來一些副作用，例如皮疹和腹瀉。使用160 mg mobocertinib最常見的副作用包括(TRAEs; 30%)：腹瀉 (90%), 皮疹 (45%)以及甲溝炎(34%), 并有17%停藥率。
在臨床中發現, 一些EGFRex20ins患者可以通過off-lable使用更高劑量的奧西替尼 (160 mg)來展現一些臨床效果（奧希替尼推薦劑量80 mg），但同時帶來了更多的毒副作用。因此，我們意識到，如果提高其對于20外顯子插入突變的活性和選擇性，可能帶來更優的臨床治療效果。Phe723是一個在P-loop的保守氨基酸，不論是T790M，還是wt (Figure 2)，甚至是20外顯子插入，其均在相同的位置上，因此我們希望提高對于EGFR (mutant or wt) reversible binding affinity，來達到最終活性的提高。由于EGFRex20ins在激酶結構域ATP結合區的氨基酸序列與野生型完全一致，因此我們可以用野生型EGFR來模擬EGFRex20ins (Figure 2)。此外，由于 wt-EGFR與ATP的結合力最強 [Ki = 5 μM], 通過增加與EGFR可逆的結合力，最終也會增加EGFRex20ins的活性，由于ATP結合力的不同，從而使得分子能增加活性的同時保持選擇性。
Figure 2A. The X-ray crystal structure of osimertinib bound to the wt-EGFR with 2.31 Å resolution (PDB:6JXT), osimertinib (cyan), Phe723 and Lys745 of EGFR (green); 2B. Surface view (yellow box: hydrophobic pocket near Phe723).
經過多輪的優化篩選，最終找到了候選分子YK-029A。其對于T790M的結合與EGFRex20ins的結合模式類似 (Figure S1)，并與設計理念吻合，通過與Phe723的疏水作用 (Figure 3)，達到了活性的提高和選擇性的保持。此外，還有一個不穩定(推測可被水分子介導)的和Lys745的氫鍵作用。
Figure 3. Predicted binding mode of YK-029Ain EGFRLR/TM (PDB:6JX0). Protein: ribbon and green (Phe723, Lys745 and Met790); YK-029A: cyan.
Figure S1. Predicted binding mode of YK-029A in EGFRex20ins (insNPG, PDB:7LGS).
此外，YK-029A的體外性質良好(Table S2)，對于多個CYP亞型沒有明顯的抑制作用，也無誘導效果。人體肝細胞代謝穩定，溶解度和透膜性良好，具有不錯的口服生物利用度。
藥效方面，YK-029A不論是在T790M共突變的CDX模型還是20外顯子插入的PDX模型均展現了良好的體內抑制效果 (Figure 5A、5B)。高劑量組均可使得腫瘤消退，并沒有明顯的毒副作用，小鼠體重降低控制在5%以內。此外，在PK-PD模型中，也再次驗證了YK-029A的靶向作用(Figure 6A、6B)。
Figure 5A. Antitumor efficacy of compound 6 in the HCC1975 xenograft model of female BALB/c mice (n = 8/group); 5B. Effects of compound 6 in the LU0387 human NSCLC PDX model of BALB/c nude mice (n = 7/group); *p<0.05; **** p<0.0001.
Figure 6A. The pEGFR signal in the LU0387 model after oral administration of compound 6 (80 mg/kg); 6B. The PK curve of compound 6 in the BALB/c nude mice.
在大鼠28天的GLP毒理實驗中, 高劑量YK-029A (80 mg/kg)展現了良好的安全治療窗口，與之相對比的是奧希替尼(80 mg/kg, 大部分大鼠死亡)。在臨床劑量爬坡實驗中，200 mg劑量下的YK-029A沒有明顯的嚴重副作用 [low grade diarrhea (≥Grade 3: 15%) and rash (≥Grade 3: 0%)]，與臨床前觀察到的安全性保持一致。
結論：通過計算機輔助藥物設計, YK-029A 被確定為新一代的EGFR抑制劑，可以同時克服敏感突變T790M耐藥，以及EGFR20外顯子插入突變。由于缺乏精確的晶體結構，通過奧希替尼和野生型EGFR的晶體蛋白結構分析：發現了一個未被其占據的疏水口袋。浦合醫藥利用該口袋設計出了新一代不可逆共價抑制劑YK-029A，YK-029A在小鼠體內 EGFRLR/TMCDX 和EGFRex20insPDX模型均展現了良好的腫瘤抑制效果。這些數據支持 YK-029A其向臨床開展，以期使得更多的非小細胞肺癌患者獲益。目前YK-029A的三期臨床試驗正在進行中。
